Chp3 Catalytic RNAs

Molecular Biology of RNA 2nd edition (David Elliott & Michael Ladomery)

 

반복해서 하는 이야기지만 RNA는 다양한 기능을 수행한다. 그 중에서도 놀라운 사실은 단연 RNA가 enzyme처럼 반응을 촉매할 수 있다는 사실일 것이다. 이러한 RNA는 특별히 Ribozyme이라고 부른다. Ribozyme은 RNA로써 substrate와 base pairing을 할 수 있기 때문에 protein에 비해 높은 specificity를 가질 수 있다는 장점도 가진다. 이러한 Ribozyme으로 가장 쉽게 소개할 수 있는 것은 Ribosome이 있다. 눈사람 모양으로 생겨 단백질 합성 기구라고 알려진 Ribosome에서 사실 catalytic reaction을 매개하는 것은 바로 RNA이다. protein은 이 ribosome의 structure을 유지하게 해주는 scaffold 역할만을 수행하고 있다. 그럼 이 RNA가 catalytic reaction을 수행할 수 있다는 사실은 어떻게 밝혀졌을까? 

 

Catalytic RNA의 우연한 발견

	pre-RNA C IVS(Circular Intervening Sequence) L IVS (Linear)  L-15 (Mature RNA)
처음 Ribozyme의 존재가 밝혀진 것은 Croup 1 intron Splicing 과정 중에 있다. Protease를 처리하면 splicing이 일어나지 않을 줄 알았는데 Mg2+만 있어도 splicing이 일어나는 것이 관측된 것이다. 이 말은? RNA 자체가 splicing을 촉진한다는 뜻이 된다. 이후 이러한 종류의 ribozyme이 많이 발견되면서 Group 1 ribozyme이라고 명명된다.

 

 

이 ribozyme들은 대체 어떠한 특징이 있기에 enzyme으로 기능할 수 있는 것일까? 

과연 그 비결은?

Ribozyme의 특징

Ribozyme의 특징은 크게 4가지로 살펴볼 수 있다.

 

1. Tertiary structure

 RNA는 coaxial structure, Hydrogen bonding, metal ion 등을 통해서 3차 구조를 형성할 수 있는데, 형성된 3차 구조가 orientaion을 유지시키고 transition state를 안정화 시키는 active site로써 기능을 할 수 있게 도와준다. 

 

2. Metal ion의 도움으로

 이걸 Ribozyme의 특징이라고 넣을 수 있는지 모르겠지만 metal ion의 덕분에 RNA는 적합한 구조를 가지며 catalytic activity또한 가지게 된다. Metal ion과의 반응을 통해 acid/base catalyst로 작용할 수 있게 되거나, Metal ion이 electrophile catalyst로 작동할 수 있게 도와준다. 또한 Metal ion은 unpaired electron과 결합하여 substrate와 intermediate, product의 안정화에도 기여한다. (뻔하지만 특히 Mg2+가 선호된다.)

 

3. Base, the H+ donor&acceptor

 생체 내에서 유의미한 pKa 값은 아니지만 ribozyme은 highly charged된 환경을 만들어서 반응을 유도할 수 있게 된다.

 

4. 2'OH

2'OH는 H를 제공해줄 수 있을 뿐만 아니라 unstability로부터 반응성을 부여한다. 특히 basic한 환경에서는 OH- base catalyst에 의해 RNA가 더 unstable해짐으로써 반응이 더욱 더 잘 촉매되게 된다. 이러한 OH기가 주로 촉매하는 반응은 hydrolysis나 trans-esterificaion으로 phosphodiester bond를 깨는 것이다. 

위의 그림에서도 OH-를 첨가해준 lane에서 더 많은 반응이 일어났다.

 

 

Are Ribozymes the catalysts?

우리는 Ribozyme이 반응을 촉매한다는 사실을 알게 되었다. 그렇다면 이 ribozyme은 catalyst라고 할 수 있을까? 

할 수 있다. 하지만 모두가 그런 것은 아니다. 촉매는 반응 속도를 높이고, 반응이 끝난 후에도 그대로 남아있어야 하는데 Group 2 intron과 같이 self cleavage를 유도하는 ribozyme은 반응 전후로 다르기 때문이다. 

 

 

바이러스의 Ribozyme

바이러스에서는 small ribozyme이 많이 발견된다. 왜 바이러스에 이러한 small ribozyme이 존재하는 것일까? 어떠한 이점이 있길래? 

먼저 Rolling circule replication으로 복제되는 바이러스에서 첫번째 이유를 살펴보자. 이러한 기전을 차용한 바이러스들은 자신의 genome을 굴리면서 빠르게 RNA multimer을 합성(이 때는 바이러스 자체의 RdRP를 사용한다.)한 다음 이들은 각각 1개의 genome으로 절단하여 사용한다.  이러한 과정에 있어서 RNA genome을 자르기에 짧은 ribonucleolytic ribozyme이 더 유리하고 경제적이기 때문에 짧은 RNA를 ribozyme으로 사용하는 것이다.  또한 이러한 Ribozyme은 Group 1 ribozyme보다 짧은 경우가 많은데 이것은 Nucleophile을 잡아두어야 하는 Group 1 ribozyme과 달리 Nu를 잡아둘 필요가 없어서 정교할 필요가 없기 때문이다.

 

Ribozyme의 분류

그렇다면 이러한 Ribozyme은 어떻게 나누어볼 수 있을까? 이들은 size에 따라 200NT가 넘는 Large ribozyme과 200NT 이하의 Small subunit으로 구분된다. 

Small ribozymes

Large Ribozymes

 

먼저 Large Ribozyme부터 살펴보도록 하자. 

 

1) Group 1 intron

 Step1: 외부 GTP의 3'OH의 attack (이 때 2개의 metal ion이 transition state 안정화 시킴)

 Step2: 5'exon의 3'OH가 3'exon의 인산기를 attack 

 

2) Group 2 intron

Step1: Branch point 2'OH의 attack(내부 Nu-의 attack)

Step2: 5' exon의 3'OH attack -> lariat(2'->5' phosphodiester bond) 형성

이 과정은 eukaryote에서 spliceosome에 의해 splicing이 일어나는 과정과 유사하다. 진핵생물에서 spliceosome은 더 정교한 조절이 가능할 수 있도록 도와주는 역할을 수행한다. 

 

다음으로 Small ribozyme을 살펴보자.

1) Hammerhead ribozyme(cleavage 효울 10^9배로 높여줌)

우선 이 ribozyme은 가장 짧은 Ribozyme으로 3개의 helix로 구성되어 있다. 이 중에서 loop를 포함하는 2개의 helix가 높은 catalytic activity를 가진다. 이 ribozyme은 cis (single moleculse, artificial)뿐만 아니라 transe (2 seperate RNA, synthesized)로도 작용한다. 

 G12와 G8이 Acid-base catalyst로, C17의 2'OH가 Nucleophile로 작용한다. G12가 C17의 2'OH에서 H를 제거하면 C17이 activation되어 인산기를 공격하게 된다. 그러면 G8이 이탈기에 H를 제공하여 반응이 완결된다. 

2) HDV ribozyme

 MG-OH와 C57이 Acid/base catalyst로 작용한다. Mg2+가 O-를 활성화시키면 C75가 이탈기에 H를 제공한다. 반응 scheme은 대체적으로 유사하다.